По данным С. С. Маренниковой, Э. Б. Гуревич, М. А. Юмашевой (1959), вирус О. н. успешно выделяется от больных из везикулярной жидкости и суспензии корок в культуре кожно-мышечной ткани эмбриона человека. Авторы получали ткань из свежих аборталышх соскобов от 8—11-недельных плодов. Трипсинизированные однослойные культуры выращивались в 0,5% растворе гидролизата лактальбумина с добавлением 15% сыворотки человека.
Для заражения использовали взвеси, содержащие по 150 000 клеток в 1 мл, которые разливали в пробирки и инкубировали 3 дня при 1° 36°. Затем раствор заменяли свежим и производили засев исследуемого материала в пробирки с наличием сплошного клеточного пласта. Для индикации вируса в ткани служила дегенерация клеток (цитопатогенное действие вируса) и гемадсорбция.
Для реакции гемадсорбции 0,2 мл 0,5% взвеси куриных эритроцитов (высокочувствительных к гемагглютинирующему действию вируса вакцины) добавляли в каждую пробирку о культурой ткани через 24 часа после заражения.
После макроскопического обследования участок оболочки с поражениями подвергают микроскопии (приготовляют окрашенные препараты) и пассажу на свежие эмбрионы. Для этой цели оболочки измельчают в ступке и в виде взвеси на физиологическом растворе 1 : 3 центрифугируют 10 мин. при 1500 об/м. В работе используют надосадочную жидкость. При отсутствии бляшек на оболочке вскрытых эмбрионов делают два «слепых» пассажа и только после этого регистрируют отрицательный результат.
Выделение вируса оспы натуральной в тканевых культурах удается при использовании перевиваемых эпителиальных клеток человеческого или обезьяньего происхождения, которые дают как размножение вируса, так и дегенерацию клеток — цитопатогенное действие (В. Д. Соловьев и Ю. Н. Мастюкова, 1958). Эти же авторы показали, что наиболее быстрым методом индикации вируса является реакция гемадсорбции, позволяющая не только выявлять его наличие в ткани, но и определять специфичность путем добавления иммунной сыворотки, подавляющей гемадсорбцию. Для этой же цели могут служить трипсинизированные однослойные культуры клеток, приготовленные из органов человека и обезьян.
При наличии смешанной популяции эпителиальных клеток и фнбробластов под действием вируса оспы натуральной преимущественной дегенерации подвергаются первые, а вторые длительное время остаются интактными. Это помогает дифференцировать цитопатогенное действие вируса оспы натуральной от вируса вакцины, который обладает выраженной цитопатогенностью как для эпителия, так и для соединительной ткани.
Диагностические исследования методом тканевых культур проводятся по следующей схеме:
Заражение развивающихся куриных зародышей и тканевых культур является наиболее чувствительным, быстрым и точным методом лабораторной диагностики оспы натуральной. Идентификация выделенного вируса и его дифференциация производятся по признакам, упомянутым выше. Затруднительнее всего дифференциация вируса оспы натуральной от вируса вакцины. Здесь дополнительно может быть применено внутри-кожное (или накожное) заражение вирусом оспы натуральной кроликов. Оно дает положительный результат лишь при введении концентрированного или слаборазведенного материала и обычно не передается в пассажах от кролика к кролику. В отличие от этого, вирус вакцины вызывает кожные поражения в ничтожных дозах и содержимое вакцинальных пузырьков легко передается в пассажах.
Заражение кроликов (Пауля метод). Раетертые корки, чешуйки, а также жидкость, полученную из оспин, наносят на роговицу глаз кроликов, предварительно проведя скарификацию поверхности путем легких надрезов слизистой оболочки. При наличии в исследуемом материале жизнеспособного оспенного вируса спустя 36—48 часов возникают мелкие округлые узелки высотой до 1 мм— оспенный кератит. Зараженный глаз извлекают и погружают в сулемовый спирт (смесь 30 мл этилового спирта, 4 г сулемы и 90 мл дистиллированной воды).
Положительная реакция Пауля определяется тогда, когда через несколько минут после фиксации на месте прививочных надрезов выявляются узелки, резко отличающиеся своим белым цветом от окружающей здоровой прозрачной ткани.
Метод Пауля менее чувствителен и точен, чем выделение вируса в развивающихся куриных эмбрионах и тканевых культурах.